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Analyse du miRNome

Analyse du miRNome

Les nouvelles technologies de génomique permettent d'analyser le miRNome et d'identifier les petits ARN non codants différentiellement exprimés, les microARN (miRNA), les petits ARN nucléaires (snRNA), les petits ARN cytoplasmiques (scRNA) pour comprendre les voies de régulation géniques et identifier de nouveaux biomarqueurs, dont des marqueurs circulant.

Ces analyses de miRNome peuvent être réalisées au niveau du génome par séquençage, microarrays, et à un niveau plus ciblé par PCR.

ViroScan3D propose ses services :

  • Analyse intégrale et sans biais du miRNome par small-RNAseq (Illumina),
  • Analyse globale du miRNome d'espèces annotées par miRarrays sur puces miRNA (Affymetrix, Agilent),et miRTLDA (Applied Biosystems)
  •  Analyse ciblée du miRNome  par miPCR (TaqMan ou SYBR Green).

  • Identification de miRNA, snRNA, scRNA différentiellement exprimés,
  • Identification de biomarqueurs de petits ARN circulant,
  • Quantification de miRNA,

  • Préparation des échantillons  : cultures cellulaires, microdissection laser,
  • Traitement des échantillons : purification des petits ARNnc,
  • Analyses de données : identification in silico des miRNA différentiellement exprimés, analyses statistiques, classements selon GO, identification des gènes cellulaires cibles candidats (interrogation de bases mirRWalk, miRAnda, Pictar, TargetScan).

Analyse du miRNome de clones cellulaires CD4+ et CD8+de patients infectés par le virus HTL-1  (Vernin et al., 2014 ; Vernin_et al., 2011). : Dans cet exemple, nous avons comparé, à l'aide de puces miRNA v3 (Agilent) le miRNome de clones cellulaires CD4+ et CD8+ de patients infectés par le virus HTLV-1 et montré, une surexpression restreinte aux CD4+, de miR oncogéniques, incluant les miR-17 et 21.

 Mise en évidence de dérégulation de miRNA dans un modèle de tumeurs endocrines (Leone et al., 2014). L'analyse de l'expression de miR, en particulier des miR-23b et 130, a permis de montrer  leur sous-expression dans des adénomes pituitaires, sous-expression associée à une surexpression de leur gènes cibles dont les gènes HMGA2 et CCNA2.

Analyse du miRNome par small-RNAseq

 

Nos services small-RNAseq vont du traitement des ac. nucléiques à l'obtention des données brutes et comprennent :

  • Le contrôle qualité des ARN totaux,
  • La déplétion des ARNr,
  • la construction des librairies small RNA, la génération des clusters (cbot Illumina) et le séquençage (Illumina)
  • L'acquisition des données comprenant : l'extraction des images, des intensités, des bases calling, le demultiplexage.

  • Les contrôles qualités (QC) des ARN, des librairies,
  • Les contrôles de séquençage après le base calling comprenant la qualité des bases (intensité et densité des clusters), la qualité des séquences (nombre de séquences passant les filtres, valeurs de phasing et prephasing, % de perfect reads, taux d’erreur mesuré sur standard interne (PhiX), Qualité des bases (Q score)
  • Les contrôles de séquençage après le démultiplexage : qualité des bases et qualité des séquences par échantillon.
  • Les fichiers standards de séquences (format FASTQ et TXT).

Analyse du miRNome par miRArray

Nos services small-RNAarrays comprennent :

  • Le design du plan expérimental (nombre d'échantillons, réplicats),
  • Les contrôles qualité des ARN totaux,
  • Le traitement des échantillons : synthèse des ADN, marquages spécifiques, hybridation des cibles sur puces, les traitements post-hybridation,
  • Les puces Affymetrix, Agilent (Gene chip miRNA 2.0 et miRNA microarrays),
  • L'acquisition des signaux et la normalisation intra-puces des données.

Vous recevez :

  • Les contrôles qualités (QC) des ARN, des marquages, , les contrôles qualités des puces et des hybridations (scatter-plots , nombre de miR présents, médianes et seuils, scaling factor, etc.),
  • Les donnés normalisées : (ex. Format XLS pour Affymetrix) et non normalisées (ex. Format CEL pour Affymetrix).

Analyse du miRNome par miRTLDA

Nos services de miR-TLDA comprennent :

  • Le design du plan expérimental (nombre d'échantillons, réplicats),
  • Les contrôles qualité des ARN totaux,
  • Le traitement des échantillons : synthèse des ADNc, pré-amplification (optionnelle), amplification des cibles et détection par TLDA  (Plaques TaqMan Low Density Amplification, Applied)
  • L'acquisition des signaux et la normalisation données.

Vous recevez :

  • Un tableau de quantification relative normalisée /miR de référence.

Quantification ciblée de miR par PCR

Nos services de quantification de miR par PCR comprennent :

  • Le design du plan expérimental (nombre d'échantillons, réplicats),
  • Les contrôles qualité des ARN totaux,
  • Le design des oligonucléotides
  • Le choix des standards internes
  • Le traitement des échantillons : synthèse des ADNc, pré-amplification (optionnelle), amplification des cibles et détection par PCR
  • L'acquisition des signaux et la normalisation données.

Vous recevez :

  • Les courbes de fusion, les courbes d’efficacité,
  • Un tableau de données normalisées / miR de référence